التحاليل الطبيه (مهم سمعه)

الاحياء الدقيقة (((مهم)))

--------------------------------------------------------------------------------

الحمد لله رب العالمين والصلاة والسلام على أشرف الأنبياء والمرسلين أما بعد...
الجراثيم كائنات دقيقه واسعة الانتشار في البيئة حولنا تعيش في التربة والماء والمواد العضوية وتسبب المرض للحيوان والإنسان والطيور والنباتات والحشرات ولها دور كبير في أحداث الأمراض الوبائية التي تصيب الصغار والكبار وتلوث الغذاء والهواء ومياه الشرب
فإنه نظرا لما يتطلبه هذا القسم الذي بدأ المستشفى يعتمد عليه في التشخيص المخبري لدى المريض لذا وجب القيام بعمل هذه النبذه المختصرة بقسم الميكروبيولوجي.
حيث يسعدنا أن نقدم بكل فخر هذا الكتاب المرشد للعامل في قسم الميكروبيولوجي.
فهو كتاب منهجي علمي مبسط أعددناه بطريقه علميه وأسلوب سلس. بحيث يستطيع أن يستوعبه كل من يطلع عليه في سهولة ويسر نظير ما قمنا به.
وقد قسمنا هذا الكتاب إلى اللغتين العربية والإنجليزية للوصول إلى المعلومة بشكل اكبر وقد تشعبنا في كل موضوع له علاقة في قسم الجراثيم لما له من أهمية في تشخيص حالة المريض المستوجب عمل التحاليل له.
وقد ضم هذا الكتاب بين دفتيه مباحث عن نظافة القسم قبل وبعد العمل وكذلك طرق استقبال العينات الخاصة بقسم الجراثيم وما إذا كانت العينات صالحه للاستقبال أو الرفض والية التعامل معها
كذلك تطرقنا للبيئات التي نتعامل معها وكل بيئة حسب الجرثومة المتوقع نموها في العينه علما أن لكل عينه نوع محدد من البيئات.
وكذلك مباحث في الأوبئة التي تسببها الجراثيم وطرق الكشف عنها

يلزم العمل بقسم الميكروبيولوجي الدقة التامة في الأداء والحرص على نظافة المعمل قبل وبعد العمل حيث أننا نتعامل مع الجراثيم الحية، في معظم الأحوال تكون ضارة ومعدية مسببة أمراض خطيرة.

التعليمات التالية:
1-أن يكون العمل مرتبا بحيث تكون الأدوات والمحاليل في أماكنها المستخدمة
2-يجب أن تكون الأدوات نظيفة ومعقمة تعقيما تاما حتى لا تكون عرضة للتلوث بحالات مرضية.
3-المحافظة على الأحواض والبنش من تلوثها بالصبغات
4-يراعى إلقاء العينات بعد انتهاء العمل منها والأدوات المستعملة في أماكنها المخصصة
5-عند العمل في العمل في الميكروبيولوجي يراعى أولا لبس القفازات والكمامة وكذلك توضع ورقة ترشيح أمامك على البنش لكي لاتسقط أي جزء من العينة على البنش فيولوثه
6-توضع العينة والإبرة في الحامل الخاص بها
7-يراعى نظافة مكان العمل بعد الانتهاء من العمل مباشرة
8-يراعى غسل ألا يدي بالماء والصابون والمطهر بعد الانتهاء من العمل مباشرة
8- يرعى عدم الأكل والشرب والتدخين أو وضع ألا يدي في الفم والعين أثناء العمل
9- حرق وإعدام المزارع والعينات بعد الانتهاء منها في فرن الحرق
طرق جمع العينات

لتشخيص الميكروب المسبب للمرض وفصله في حالة نقية يجب اخذ العينة من مكان الإصابة في جسم الإنسان أو الحيوان أو أي سائل محتمل وجود جراثيم مرضية به.

تعليمات مهمة لجمع العينات:

• يستحن أن تؤخذ العينة من المريض قبل بدء العلاج بالمضادات وذلك لأنها تؤدي إلى عدم نمو الميكروبات على البيئات وبذلك تعطي نتائج غير صحيحة
• تؤخذ عينات البلغم للكشف عن الدرن في الصباح وكذلك عينات البول وتكون من الوسط وهذا هو الأفضل
• عند اخذ مسحات من الحلق أو الزور يراعى أن يكون الحلق أو الزور قد مس بأي مطهر أو غرغرة قبل اخذ العينة
• أن تكون العينة المراد زراعتها في كونتينر خاص ومعقم
• أن يرفق بالعينة الركوست الخاص بها ومبين فيه الأتي:

1. اسم المريض
2. رقم ملف المريض
3. عمر المريض وجنسه
4. قسم المريض
5. نوع العينة
6. نوع الفحص المطلوب
7. عما إذا كان المريض يأخذ مضادات حيوية ونوعها
8. وكذلك نبذه عن تشخيص المريض
9. اسم الطبيب المعالج وختمه
• توضع في أوعيه أو حاويات معقمة وجافه ويجب أن تكون محكمة الإغلاق
• تأكد من أن المعلومات مسجلة على العينة
• وضع رقم تسلسلي خاص بقسم الميكروبيولوجي
• التأكد من أن السوائل لا تتسرب من الأنبوب حتى نتفادى الأخطار حتى لا تنتقل العدوى
• التعامل مع العينات في كابينة خاصة حتى لا تؤدي إلى انتشار العدوى

العينات التي يجب رفضها وعدم استقبالها1-عينه ليس عليها البيانات الكافية من اسم المريض والتاريخ ونوع العينة وخلافه ...
2-عينة بدون ركوست
3-عينه بها تسرب
4-عينة تأخرت أكثر من 12 ساعة
5-عينه في حاويه غير نظيفة وليست بالمواصفات المطلوبة
6-عينة بلغم وليست ببلغم ولكنها لعاب فقط


البيئات culture media

هي الوسط الصناعي الذي تنمو وتتكاثر عليه البكتريا لأنه يحتوي على المواد الغذائية اللازمة للميكروب والتفاعل الهيدروجيني المناسب له ويضأ يحتوي على الأكسجين أو ثاني أكسيد الكربون ويحتوي أيضا على الأحماض الأمينيه والأملاح المعدنية وكل ميكروب ينو ويتكاثر على مستنبت خاص به حيث يحتوي على متطلباته



مثل:
1-Blood Agar
2-Maconkey Agar
3-Chocolate agar
4-Cled Agar
5-Salmonella Shigella Agar (S.S.A).
6-Maconkey Agar. MA.
7-XLD Agar.

ملاحظات هامة عند الزرع
• يلاحظ عند اخذ العينة باللوب التأكد من ملء دائرة اللوب بالعينة وإخراجها من الأنبوبة باحتراس حيث لا تلمس جدار الأنبوبة.
• عند الزرع على الطبق يراعى عدم الضغط على البيئة مما يؤدي إلى تجريح سطح البيئة
• يلاحظ فتح الطبق بمقدار معين وغلقة بعد وضع المزرعة بسرعة حتى لا تتعرض للتلوث
• إبعاد الطبق عن التنفس أثناء الزرع لعدم تلوث الطبق بالبكتيريا الموجودة في زفير الشخص الذي يعمل في المزرعة
• وضع الطبق في الحاضنة بحيث يكون الغطاء للأسفل
• يتم قراءة الأطباق في اليوم التالي وتتم القراءة أولا بعدد المستعمرات(colony count)

ثم تصنف كالأتي• إذا لاحظت نمو أكثر من نوعين من المستعمرات على نفس الطبق فان ذلك يعني تلوث ويتوجب طلب عينه أخرى ويتم زرعها
• إذا كان عدد المستعمرات اقل من 10 مستعمرات فإن ذلك يهمل ويعتبر غير ذو قيمة وليس له أهمية No significant growth
• إذا كان عدد المستعمرات من 10-19 مستعمرة فإنه يعتبر مشكوك فيه ويتم عمل حساسية له وتكتب النتيجة النهائية له.
• إذا كان عدد المستعمرات أكثر من20 فإن ذلك يعتبر نمو حقيقي ويتم عمل اختبارات الحساسية له




عينات البولURINE

البكتيريا المحتمل وجودها في عينة البول:• المكورات العنقودية الذهبية staph.aureus
• المكورات السبحية البراز يه
• عصيات الحميات المعوية (التيفود)
• عصيات القولون E.coli ,Strept. faecalis
• عصيات البروتيص
• السيلان
• السل

البيئات المستخدمة في عينات البول:
Blood agar:
بعض أنواع البيئات لا تنمو ألا بوجود الدم مثل:
الالتهاب السحائي الوبائي _الالتهاب الرئوي.
بعض أنواع البكتيريا تفرز خمائر تذيب كرات الدم الحمراء فيمكن التعرف عليها مثل الأنواع المختلفة من المكورات السبحية.

وأهميتها في تمييز نوع التحلل ألفا, بيتا, جاما
Chocolate agar:يستخدم في مزارع الالتهاب الرئوي-السيلان-الأنفلونزا
وأهميتها أيضا في تمييز نمو بكتيريا نيسيريا, هيموفلص
: MacConkeys medium

وهو للتعرف على البكتريا المخمرة لسكر اللاكتوز(لون احمر أو وردي) والتي لاتخمرة (نفس لون البيئة) وتنمو فيها عائلة البكتيريا المعوية

: Cled agar

للتفريق بين البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز والتي لاتخمرة وتحد من نمو بكتيريا البروتيص
طريقة أخذ العينة:

• أن تكون العينة من وسط البول وذلك حتى لا تحتوي على إفرازات من مجرى البول.
• أن يراعى التنبيه على المريض وخصوصا السيدات بغسل الأعضاء التناسلية الخارجية جيدا بالماء والصابون.
• يجب أن تفحص العينة خلال 3 ساعات من جمعها حيث أن تكاثر ونمو البكتيريا مما يودي إلى خلل في النتائج الكيميائية مثل نقص الجلوكوز وخلافه.
طريقة الزرع:

1) يتم تسجيل العينة ووضع البيانات في الملف الخاص بالزرع.
2) يتم تسجيل رقم العينة الخاص بالمختبر على الطبق
3) يتم خلط العينة بهدوء لتوزيع أي راسب يكون في قاع العينة.
4) يتم الزرع بأخذ نقطه أو نقطتين من البول ويتم وضعها داخل طبق الزرع
5) يتم توزيع نقطة البول في الطبق باستخدام الإبرة حسب ميكانيكية معينه.
6) توضع الأطباق في الحاضنة عند درجة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.








هذا الطبق يوضح بكتيريا E.coli


عينات البراز
البكتيريا المحتمل وجودها في عينة البراز:
• السالمونيلا والشيجيلا
• الكوليرا
• المكورات العنقودية الذهبية staph.aureus
• الإيشريشيا كولاي
• البروتيص

هذه الصورة توضح Proteus :



البيئات المستخدمة في على وجه العموم فهي كما يلي:
S.S agar:
تستخدم للعينات البرازية وهي بيئة انتخابية حيث أن هذه البيئة تثبط نمو البكتيريا الموجبة للجرام وكذلك تحتوي على مثبطات نمو البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز.
فبنسبة للسالونيلا في XLD فلونها زهري والمركز توجد نقطة سوداء
أما في الشيجيلا فلونها زهري وبدون مركز اسود اللون السائد زهري


EMB:بيئة تفريقية لعزل البكتيريا المعوية السالبة للجرام مثل: سالمونيلا, بروتيص, شيجيلا حيث تحتوي هذه البيئة على دليلين هما Eosine وMethylene blue الذين يفرقان بين البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز وغير المخمرة

: DCAتحوي سكر اللاكتوز لذلك تفرق بين المخمرة وغير المخمرة لونها احمر فاتح يقترب من البني في حالة التخمر يتحول لونها إلى الأحمر الباهت.
حيث السالمونيلا لا لون لها وفي المركز نقطة سوداء
أما الشيجيلا فهي بدون لون


S.B) Selenite broth(وهي بيئة سائله غنية لنمو السالمونيلا بأنواعها











المســحـــاتSWABS

البيئات المستخدمة في عينة المسحة:
Blood Agar*
*Sabouraud Agar
Macconkey Agar*
*Chocolate Agarأما البكتيريا المتوقع نموها فهي كالتالي وذلك حسب المنطقة المعزولة منها:
1-Beta.Hameolytic Streptococci.
2-Corynebacterium Diphtheriae.
3-Bordetella Pertussis.
4-Meningococci.
5-Staph Aureus.
6-Haemophills Influenzae.
7-Candida albicans.
أنواع المسحات:

1) مسحة من الزور أو الحلق في حالة الدفتيريا – التهاب الزور تزرع على B.A لاحتمال وجود المكورات السبحية المذيبة للدم أو العنقودية الذهبي تزرع على MAC عينات سلبية للجرام
2) مسحة من الجروح والدمامل والناسور
3) مسحة من الشرج في الأطفال في حالة الدوسنتريا
4) مسحة من الشرج في حالات الوفاة كما في الكوليرا
5) مسحة من التقيحات التي بالأذن، الأنف، العيون
تزرع على BA لا هوائي وهوائي وأيضا MAC
6) مسحة من الرحم كما في حالة السيلان- حمى النفاس
تزرع على BA+CO2 لاحتمال وجود مكورات سبحية مذيبة للدم
تزرع على MAC لاحتمال وجود العصيات سلبية جرام (بكتيريا القولون)
البيئات المستخدمة في عينة المسحة:

نستعمل Blood Agar و Macconkey Agar فقط
أما في حالة مسحة من الرحم أو العين فنستعمل Blood Agar و Chocolate Agar


التعرف على البكتيريا

الفحص الميكروسكوبي عن طريق صبغ العينة:

أهمية الصبغة:
1. رؤية البكتيريا والتعرف عليها.
2. بعض أنواع الصبغات تستخدم في التفرقة بين أنواع البكتيريا مثل صبغة جرام التي تفرق بين الإيجابية والسلبية وصبغة زيل نلسن تصبغ البكتيريا المقاومة للأحماض.

أنواع الصبغات:

**صبغات بسيطة:
• methylene blue stain
• صبغة كاربول فوكسين






**صبغات مركبة:وهي الصبغات التي تستخدم فيها أكثر من صبغة أولية
• صبغة جرام:
وهي تتكون من صبغة الميثيل فيولت Methyl violet وكذلك صبغة اليود Lugol's iodine

• صبغة الزيل نلسن:
تستخدم هذه الصبغة لصبغ البكتيريا المقاومة للأحماض (Acid –Fast) مثل الميكوبكتيريا وذلك لاحتواء هذه البكتيريا على مواد شمعية لذلك يلزم استخدام مثل هذه الصبغة مع التسخين.

وسوف نتحدث عن صبغة جرام وصبغة الزيل نلسن بشي من التفصيل في الصفحة القادمة



صبغة جرام


• تحضير اللطخة البكتيرية باستخدام محلول ملحي

• غمر الشريحة بمحلول Crystal violet لمدة 30الى 60 ثانية

• غسل الشريحة بماء الحنفية الهادي


• غمر الشريحة بمحلول اليود لمدة 30الى 60 ثانية

• غسل الشريحة ثم اغمر في الكحول المطلق لمدة 60 ثانية



• غسل الشريحة جيدا ثم اغمر في صبغة Safranin لمدة 30 إلى

• 60 ثانية.


• غسل الشريحة ثم جففها



• فحصها




صبغة زيل نلسن


• تحضير لطخة من البلغم الغليظ ( لاحتمال وجود عصيات السل بكمية اكبر) على شريحة زجاجية مع التثبيت بواسطة اللهب.
• غمر الشريحة بصبغة الكاربول فوكسين مع التسخين حتى يتصاعد البخار وظهور لون ذهبي ننتظر لمدة 3-4 دقائق.

• غسل الشريحة بماء الحنفية الهادي.
• غمر الشريحة في أسيد الكحول لمدة 5 دقائق حتى تصبح اللطخة لونها زهري فاتح ( لإزالة الصبغة من البكتريا).
• غسل الشريحة بماء الحنفية الهادي.
• غمر الشريحة بصبغة المثيلين بلو من 2-3 دقائق.
• اغسل الشريحة بماء الحنفية الهادي
• أجففها بواسطة ورق ترشيح
• ومن ثم الفحص

ملاحـظـه:
• يستحسن استخدام ماء مقطر في عملية الغسيل حيث توجد أنواع من البكتيريا المقاومة للأحماض في مياه الصنبور
• البعض يستخدم أنية خاصة لصبغ عدد من الأفلام مرة واحده وهذا خطاء فربما انتقلت البكتيريا المقاومة للأحماض من عينه ايجابية إلى أخرى سلبية فيجب الصبغ كل شريحة على حده
• يجب عمل شريحتين لكل عينة وفحص كل شريحة لمدة 20 – 30 دقيقة لأنه إذا وجد في الفلم كله عدد 1 عصية سل يدل على أن الميكروب يوجد بنسبة 000, 10 مكبرة لكل 1سنتيمتر مكعب في عينة البلغم
فحص البيئات والتعرف على المستعمرات

• وصف المستعمرة:
الحجم – الشكل – شفافة أو معتمة – جافه أو مخاطية – مسطحة أو مرتفعة – ذات حافة محدده أو مشرشره
اللون حيث أن هناك نوعين فبعضها تعطي صبغة داخلية مثل المكورات العنقودية الذهبية ومستعمرة تعطي صبغة خارجية تنتشر في البيئة مثل عصيات الصديد الأزرق.
• التحلل الدموي في أطباق أجار الدم:
حيث هذه الخاصية تقسم المكونات السبحية إلى ثلاث أنواع:
- مكورات سبحية بيتا ------ تحلل كلي حول المستعمرة
- مكورات سبحية آلفا ------ تحلل جزئي حول المستعمرة
- مكورات سبحية جاما ----- لا تحلل الدم.

• مخمرة للاكتوز أو غير مخمرة:
في أطباق ماكونكي أجار:
حيث المخمرة تعطي اللون الوردي والغير مخمره تعطي اللون الأصفر
في أطباق كليد أجار:
حيث المخمرة تعطي اللون الأخضر والغير مخمرة تعطي اللون الأصفر

• أنواع البيئات المنماة عليها:حيث أن كل ميكروب يفضل بيئة معينه لنمو فها والبعض لا ينمو في بيئات أخرى في وقت أنها مناسبة للميكروبات أخرى.
وبالتالي تعتبر خاصية للتفرقة بين أنواع الميكروب.





الاختبارات البيوكيميائية

1- اختبار الأكسيديز: (ورقة ترشيح):عندما تكون البكتيريا سالبة للاكتوز نقوم بهذا الاختبار
فإذا كانت النتيجة موجبة فالبكتيريا سيدومونص
وإذا سالبة فنعمل API
إذا اختبار الأكسيديز هو للتفرقة بين سيدومونص والبكتيريا الأخرى

2- اختبار الكتاليز: (الشريحة والغاز):
عندما تكون البكتيريا موجبة اللاكتوز نقوم بهذا الاختبار
فإذا كانت النتيجة موجبة فهي ستاف ونتجه لعمل Dnase
وإذا سالبة فهي ستربتو ونعمل اختبار المجموعة

* هنا في هذا الاختبار لايتم عمله إلا إذا حصل تحلل (ستناف, ستربتو)

3- اختبار naseوهو اختبار يكون على بيئة Dnase وهي للتفرقة بين الستاف والستربتو حيث يتم بإضافة HCL

4- اختبار API:


وبعد ذلك نقوم بعمل أقراص الحساسية حسب البكتيريا المكتشفة عندنا


اختبارات الحساسية للمضادات الحيوية

نعمل هذه الاختبارات وذلك بالزرع علىMueller Hinton agar وذلك عن طريق الزرع بواسطة البكتيريا الممرضة المنماة مسبقا. بحيث نأخذ من طبق البكتيريا مستعمره واحده نقيه ويتم زراعتها على طبق Mueller Hinton agar ويوضع عليها أقراص الحساسية الخاصة بكل نوع من الجراثيم وتحضن لمدة 24 ساعة.
يستخدم blood agar بدلا من Mueller Hinton agar في حالة:
المركسبلا
المكورات السبحية بأنواعها

يستخدم Chocolate Agar في حالة:
النيسيريا
عصيات الأنفلونزا

مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم مع المكورات العنقودية والسبحية:بنسلين - اوكساسلين- إثروميسين - كيفالوسين - كوتركساسلين - كلينداميسين تيتراسيكلين -امبسلين- اجمنتين- سيفوكسين- سيفوتاكسيم- جاراميسين- توبراميسين.

مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم للعصيات السلبية جرام:
امبسلين- اجمنتين – سيفوكسين – سيفوتاكسيم – جاراميسين – توبراميسين كيفالوسين – كوترموكساسلين – اميكسين – امبينم – اذترونم – ببراسلين – كبروفلوجزاسلين – كلورامفينكول – تيتراسيكلين – سيفتازيديم.


مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم في عصيات الصديد الأزرق:اميكاسين – كاربنسلين ببراسلين – نتلميسين – توبراميسين – جنتاميسين – سيفتازيديم – سفترياكسون.

مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم مع الميكروبات المفصولة من البول:
نالدكسك أسد – نيتروفيورانتوين – نورفلوجساسين – ميثلينم – امبسلين – جنتاميسين – كيفالوسين – كوترموكساسلين.

تسجل النتائج كالتالي
حساسة ( S ) Sensitive
متوسطة الحساسية ( I ) Intermediate
مقاومة ( R ) Resistant